慢病毒感染标记细胞株：在细胞系中稳转特定的标签，如Luc、GFP、RFP等，标记的细胞株可作为示踪工具细胞，在肿瘤实验中，通过将标记的肿瘤细胞接种到动物体内，采用生物发光成像或荧光成像技术实时监测动物体内肿瘤的生长进展。

 

1、前言

细胞毒性是指医疗器械或生物材料对细胞造成损伤的程度，细胞毒性试验评估待测样品对培养的哺乳动物细胞毒性反应。其原理为黄色水溶液MTT在活细胞内代谢性还原，生成不可溶的甲臜。活细胞的数目与甲臜溶于醇类后用光度计测定的色度相关。

2、试验依据标准

GB/T 16886.5 -2022 医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验。

3、试验系统

MFC细胞。

4、试验样品制备

依据GB/T 16886.12制备浸提液。

5、试验步骤

5.1 细胞培养准备

采用酶促消化（胰蛋白酶/EDTA）将培养细胞从培养瓶中移出，细胞悬液在1000rpm/min离心5min。弃去上清后，用培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×105/mL，取100μL细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，培养板外围孔每孔加100μL空白培养基。

将细胞培养板放置于（37±1）℃，5％CO2培养箱中放置24h，培养至半融合单细胞层。在倒置显微镜下观察每个孔，确保各孔细胞增长相对相等。

5.2 接触培养

培养24h后，从板孔中吸出培养液，另加入100μL的样品测试浸提液、对照样品浸提液、空白对照液和阳性对照浸提液，所有剂量需要做至少6个平行。将空白板加到96孔板的左（第2列）、右（第11列）两侧。然后将细胞培养板放置于（37±1）℃，5％CO2培养箱中放置24h。

5.3 观察

继续培养24h后，在相差显微镜下检查每个板，判定细胞接种系统误差和对照与试验组细胞的生长特性。记录试验样品浸提液细胞毒性作用导致的细胞形态学方面的改变，但这些记录不用与任何细胞毒性定量测定。对照细胞的不良生长特性可表明实验误差，并且可能会因此放弃该试验。

5.4 添加MTT

观察结束后每孔加入100μL MTT（5mg/mL）溶液，37℃，5%CO2培养箱孵育4h，弃去MTT溶液，每孔加100μL DMSO溶液，振荡10min，在570nm波长下测试吸光度值。

5.5 数据分析

细胞毒性：按下列计算公式计算细胞存活率。存活率%=（OD570e/OD570b）×100%。

式中：OD570e为试验样品、阳性对照、阴性对照各组测得的光密度平均值；OD570b为空白对照组光密度平均值。

如细胞存活率下降到<空白的70%，则具有潜在细胞毒性。试验样品50%浸提液存活率与100%浸提液相同或较高，否则宜重复试验。